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菌種有着哪些保存方法

更新日期: 2021-08-26
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  菌種是從事微生物學及生命科學研究的基本材料,在醫學領域中,診斷制品的制備,菌苗的生産、微生物緻病性研究,藥物的抑菌試驗及藥品微生物檢驗等都有一套完整的菌種菌種分為母種(一級種)、原種(二級種)和栽培種(三級種)三級。
 
  工業發酵的有用菌種,其篩選步驟包括菌種分離、初篩和複篩,挑選具有某種能力的有用菌種。分離就是首先是從土壤或腐生植物中收集含菌樣品,用無菌水稀釋後,塗布于置有适宜細菌、放線菌或黴菌生長的瓊脂培養基平皿上,并将其倒置于恒溫箱中,培養一定時間,平皿上長出的許多單個菌落(單一微生物的集落)經分别分離後即為各種純種菌株,簡稱純種,移種至試管斜面培養基上,置4℃冰箱備用。
 
  菌種是從事微生物學及生命科學研究的基本材料,在醫學領域中,診斷制品的制備,菌苗的生産、微生物緻病性研究。
 
  1、梭氏法
 
  将容有1滴細胞懸液的小管﹐置于盛有氫氧化鉀或五氧化二磷吸水劑的大試管中﹐用真空泵抽至1、3帕時﹐将大試管密封保存。這是為減少細胞死亡率而采取的一種不經凍結﹑緩慢脫水的幹燥保藏法﹐适用于多種細菌﹑真菌。
 
  2、冷凍真空幹燥法
 
  将細胞懸液每0、1~0、2毫升注入一無菌安瓿瓶﹐于-40℃預凍1小時﹐再于-20~30℃﹑真空度為13、3帕的條件下脫水。在脫水過程後期﹐安瓿瓶外溫度可逐漸升至25℃。脫水後的樣品含水量應在3%以下。後﹐将安瓿瓶保持真空度1、3帕﹐用火焰溶封﹐置10℃保存。為防止細胞在凍結和脫水過程中損傷或死亡﹐要用保護劑制備細胞懸液。保護劑有脫脂牛奶﹑血清﹑10%蔗糖或葡萄糖溶液等﹐其作用是通過氧和離子鍵對水和細胞所産生的親合力來穩定細胞成分的構型。此法适用于病毒﹑衣原體﹑枝原體﹑細菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌等的長期保存﹐是當前保藏菌種的一個重要方法。但是﹐鹽杆菌﹑發光杆菌﹑黏杆菌﹑阿舒囊黴﹑多囊黴﹑擔子菌中的大多數屬種不适用于此法保存。
 
  3、液态氮超低溫凍結法
 
  用甘油或二甲亞(DMSO)作保護劑制備細胞懸液﹐分裝入無菌安瓿瓶﹐每管0、2毫升﹐在控制溫度下降速率為1℃/分鐘的條件下預凍至-40℃﹐然後立即放入液氮生物貯存罐中氣相(-150℃)保存。恢複培養時﹐先直接侵入38℃水浴中解凍5~10分鐘﹐再種植于适宜培養基内培養。這是根據在低于-130℃時一切生化反應處于停止狀态﹑微生物也不能進行代謝活動而設計的凍結法。為避免凍死﹑凍傷和細胞内形成大量冰晶﹐用保護劑制備懸液并控制預凍時的冷卻速率和解凍時融化速率。微生物的大多數屬種适于慢速凍結和快速解凍。此法适用于病毒﹑枝原體﹑各種細菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌﹑藍藻等。
 
  4、定期移植法
 
  将菌種接種于所要求的培養基上﹐在适溫度中培養﹐至靜止期或産生成熟的孢子時﹐置入5℃的冰箱(或冰庫)保存。在培養和保存的過程中﹐由于代謝産物的累積而改變了原菌的生活條件﹐結果菌落群體中的個體就不斷衰老和死亡﹐因此每5~15天或1~4個月重新移植一次﹐具體間隔時間因種而異。凡能人工培養的微生物都可用此法保存。此法不需特殊設備﹐但煩瑣﹐費時﹐而且經常移植容易引起菌種退化。
 
  5、礦油封藏法
 
  将化學純的液體石蠟(礦油)經高壓蒸氣滅菌﹐放在40℃恒溫箱中蒸發其中的水分﹐然後注入斜面培養物中﹐使液面高出斜面約1厘米。将試管直立﹐放在15~20℃室溫中保存。由于在斜面培養物上覆蓋一層液體﹐既能隔絕空氣﹐又能防止培養基因水分蒸發而幹燥﹐可以延長保藏的時間。但注入的液體必須不與培養基混溶﹑對菌種無毒﹐不易被利用和揮發。此法适用于酵母菌﹑芽孢杆菌﹔不适用于固氮菌﹑乳酸杆菌﹑明串珠菌﹑法門氏菌和毛黴目中的大多數屬種。此法簡便易行﹐但必須注意防火和污染。
 
  6、沙土管法
 
  将沙或土過篩﹑烘幹﹑裝管﹑滅菌﹑然後将菌種制成孢子懸液滴入其中混勻﹐放到盛氯化鈣的幹燥器裡吸除水分﹐幹燥後保存或用火焰封管後保存。吸附在幹燥沙土上的孢子因缺水而處于休眠狀态﹐可保存較長時期。此法适用于芽孢杆菌﹑梭狀芽孢杆菌﹑放線菌﹑鐮刀菌等。
 
  7、麸皮法
 
  将麸皮制成培養基﹐培養要保存的菌種﹐待生長良好後﹐置幹燥器中保存。這是根據中國釀造酒﹑醋﹑醬時制曲的經驗所采用的一種保藏方法﹐适用于谷物微生物區系中的種類。
 
  8、L-幹燥法
 
  又稱液體幹燥法或真空幹燥法﹐用含3%谷氨酸鈉的0、1M磷酸緩沖溶液(pH7、0)做分散媒﹐将待保藏的微生物制成高濃度的細胞懸液﹐滴入無菌安瓿瓶中﹐每管0、05毫升﹔将安瓿瓶固定在多歧管上﹐并以水浴保持安瓿瓶内樣品溫度為10℃﹐在13、3~1、3帕的真空度下幹燥﹐火焰封管保存。此法不經凍結﹐用真實泵迅速抽乾﹐可避免菌種的凍傷或死亡。廣泛應用于病毒﹑噬菌體﹑細菌﹑酵母菌﹑藍藻﹑原生動物等。
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