柱式病毒DNA提取純化試劑盒

柱式病毒DNA提取純化試劑盒是在一管式病毒 DNAOUT 的基礎上開發的、專門用于從血清(血 漿)等液體樣品及拭子（咽拭子、鼻拭子、口腔拭子、陰道拭子等）中提取微量病毒 DNA 的産品，它具有下列特點：

1. 操作簡單，整個過程隻需要 20 分鐘左右，不需要額外在洗柱液中補加乙醇。

2. 靈敏度高，通過 PCR 檢測到的終靈敏度可以達到 30-50 拷貝/mL。

3. 安全無毒。

4. 如果加上病毒離心富集步驟，多可以處理 1.5 mL 液體病毒樣品。

5. 與 PCR 和熒光 PCR 兼容。

6. 價廉物美，性價比遠高于國外同類産品。

7. 适用于各種材料，包括血清、血漿、腦脊液、尿液、糞便、培養細胞上清液等無 細胞材料。

常溫運輸及保存，DNA 病毒裂解液長期（1 月以上）放置時需要放 4℃，有效期一年。

1. 如果有 N 個樣品，标記 N+2 個 1.5-2 mL 螺旋蓋塑料離心管，多出的一個為陽性對照，一個為陰性對照。為避免污染， 建議不要使用壓蓋式塑料離心管。在每個管上做個标記，以在後續操作時區别向 心面和離心面。然後在離心管中分别加入 0.2 mL 液體樣品（血清、血漿、尿液、 腦脊液、唾液、眼淚等等），陽性對照和陰性對照。

1.1、 如果是口腔拭子、咽喉拭子等各種拭子樣品，則将拭子放入 0.2mL 自備 生理鹽水中擠壓出液體，然後取 0.2mL 進行提取。

1.2、 如果是糞便等半固定樣品，則取約 0.3mL 的樣品，加入 0.3mL 自備生 理鹽水，震蕩重懸，離心取 0.2mL 上清進行提取。

1.3、 如果血液，細胞培養液等含細胞的液體，可以離心用上清，也可以直接取 用，但後者提取的病毒 DNA 中會有少量細胞的基因組 DNA 污染（但不 影響 PCR）。血漿的抗凝劑必須是 EDTA 或 ACD，不能是肝素。使用 ACD 時由于所加入 ACD 會增加體積，樣品會被稀釋，得到的病毒滴度 會比使用 EDTA 低 15%左右。血漿按 0.6mL/管的量分裝保存，以 避免反複凍融。

1.4、 如果樣品是實體組織或培養細胞，則需要在自備生理鹽水中勻漿後離心， 用 0.2mL 上清液（含病毒）進行提取，但此種情況下後得到的病毒 DNA 不可避免的會含有少量基因組 DNA 污染（但不影響 PCR 檢測）。

1.5、 如果液體樣品中的病毒需要富集，可以使用 1.5 mL 上述方法得到的液體 在 4℃ 24,000 g 冷凍離心 60 分鐘, 移棄 1.3 mL、用剩下的 0.2mL 繼 續操作。

2. 加入 0.6 mL DNA 病毒裂解液到各離心管中，振蕩 30 秒混勻後室溫放置 10 分 鐘裂解病毒。注意：DNA 病毒裂解液在 4℃放置後可能會産生沉澱，使用前必須 放在 65℃水浴使沉澱*溶解并充分搖勻後再取用。

3. 加入 0.8mL 上柱結合液到離心管中，颠倒混勻後轉移一半的混合液（0.8mL） 到離心吸附柱中，室溫放置 2 分鐘。

4. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘，棄收集管中的穿透液，把離心吸附柱放回到收集 管中。

5. 将剩餘的另外一半裂解液（0.8mL）轉移到離心吸附柱中，室溫放置 2 分鐘。

6. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘，棄收集管中的穿透液，把離心吸附柱放回到收集 管中。

7. 加入 0.7 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中，12,000 rmp 室溫離心 1 分鐘，棄收 集管中的穿透液，把離心吸附柱放回到收集管中。

8. 加入 0.3 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中，12,000 rmp 室溫離心 1 分鐘，棄收 集管中的穿透液，把離心吸附柱放回到收集管中。此為第二次洗滌，可以跳過。

9. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘（幹甩），棄含穿透液的離心管。

10. 将幹甩後的離心吸附柱套入到一個自備的 RNase-free 的 1.5 mL 離心管中，在 離心吸附柱的濾膜的中部加入 30-100 uL DNA 洗脫液 3.0，然後室溫放置 2 分 鐘。

11. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘，離心管中的溶液即為病毒 DNA 溶液。

12. DNA 樣品可以直接用于 PCR，也可放-20℃長期保存。 

柱式病毒DNA提取純化試劑盒